2019年10月1日，5-羟甲基化胞嘧（mì）啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在（zài）糖尿病研究领域取得重要进展。2型（xíng）糖尿病（T2D）的血管并发症（zhèng）是导（dǎo）致2型（xíng）糖尿病致残致（zhì）死的重要病因，一直缺乏一（yī）种无创便捷的临床途径实现（xiàn）血管并发症（zhèng）的发生发展监测，达到早发现、早干（gàn）预，以提高T2D病人的整体生（shēng）活质量，减少卫生经济负担。

该研究入组（zǔ）了（le）62例（lì）2型糖尿（niào）病病（bìng）人，采用（yòng）5hmC-Seal技术（shù）对血浆cfDNA中表观遗传（chuán）标志物5hmC的分布情况进（jìn）行检（jiǎn）测，分析5hmC标志物与2型糖（táng）尿病血管并发症发（fā）生发展（zhǎn）的相关性。结果表明5hmC标（biāo）志物的变化（huà）与T2D合并（bìng）大血管/微血管事件具有相关性，主要涉及一些与（yǔ）血管（guǎn）生物学和糖（táng）尿病（包（bāo）括胰岛素耐（nài）受和炎症反应）相关的基因和（hé）信号通路。该（gāi）研究建立的16个基因-5hmC标志物组合检测（cè）可以准确区分（fèn）有并发（fā）症和无（wú）并发症的（de）2型糖（táng）尿（niào）病病人[实验组：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明（míng）显优于传统（tǒng）临床变量例如白（bái）蛋（dàn）白尿。除此之外（wài），还建立了13个（gè）基因-5hmC标志物组合检测，可以进一步区分（fèn）T2D合并单一并发症和多（duō）种（zhǒng）并发症[实验组：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同（tóng）样明显优（yōu）于其他传统（tǒng）临床变量。该研究得出结（jié）论（lùn），5hmC标志物反映（yìng）了（le）T2D病人大血管/微血管并发症（zhèng）发（fā）生过程中的表观遗传变（biàn）化（huà），因而5hmC-Seal检（jiǎn）测技术在监测（cè）糖尿病血（xuè）管并发症发生和进展（zhǎn）方面具有（yǒu）良（liáng）好的临床应用前景。

本研究共（gòng）纳入62例2型糖（táng）尿病病人，包括没有（yǒu）血管并（bìng）发症的病人12例，有单一（yī）血管并发症的病人34例（24例发生（shēng）大血管事件（jiàn），10例发生微血管事件），以及有（yǒu）多种血（xuè）管并发症（zhèng）的（de）病人16例。试验收集62例病人血浆，提取cfDNA，利用5hmC-Seal技术捕（bǔ）获外周血cfDNA中的（de）5hmC序列，进行二代测序，通过生物信息学分析找（zhǎo）出并发症组与无（wú）并发症组（zǔ）之间有显著5hmC修饰差异的基因（yīn），单一并发症组和多种并发症组（zǔ）之（zhī）间有显著5hmC修饰差异的基因。随后利用回归模（mó）型对差（chà）异（yì）基因进（jìn）一步筛选、优化，弹性网络（luò）进（jìn）一（yī）步筛选，计算加权平（píng）均分，最（zuì）后得到一组具有高度（dù）灵敏度和（hé）特异性的5hmC生物（wù）标记物，并（bìng）进一（yī）步在（zài）实验组中验（yàn）证，分（fèn）析其灵敏度和特异性。并将新建立（lì）的5hmC标志物基（jī）因组合的检测性能与传统临床变量进行对（duì）比分析。最（zuì）后对相（xiàng）关基因（yīn）进行了（le）信号通路分析和功能探究（jiū）。

5hmC修饰水平与血管并发症具有相（xiàng）关性（xìng）

利用逻辑回归模型对62例有并发症和无并发症2型糖尿病病人的5hmC差异水平进（jìn）行（háng）分析发现，有（yǒu）并发症2型糖尿病病人的622个差异修饰候选基因（包括上调和（hé）下调基（jī）因）的归一（yī）化平均（jun1）数要明显高于无并发（fā）症的病人（P<0.001），但是单一并发症（zhèng）和多发并（bìng）发症病人之间没（méi）有显著差异。

之后将有单一并发症或多种并发症的50例病人用逻辑回归模（mó）型进行了对比，发现多种并发（fā）症的病人（rén）的153个差（chà）异修饰候选基因（包括上（shàng）调和下调基因（yīn））的归一（yī）化平均数要低于无并（bìng）发症病（bìng）人（P<0.001）。

5hmC标（biāo）志（zhì）物可区（qū）分有无并发症（zhèng）患者

62例2型糖尿病病（bìng）人被随机分成训练（liàn）组（n=31）和测（cè）试组（n=31）。利（lì）用（yòng）弹性网络筛选（xuǎn）后发现，16基因-5hmC标志物组（zǔ）合检测可以用于区（qū）分有（yǒu）并发症（zhèng）和无并发症的2型糖尿病（bìng）病人（rén）。

基于16基因组合模型 (Detection Model 1) 的加权（quán）平均分分析，发现无并发症病人的（de）分数在训练集和测试集中（zhōng）都明（míng）显（xiǎn）低于有并发症的病人（rén）。只考虑加权平均分（fèn）的话（huà），受试者（zhě）工作特征曲线（xiàn）（ROC）分（fèn）析（xī）表明将cutoff值（zhí）设（shè）置（zhì）成0.5时，在测试（shì）组中中（zhōng）的灵敏度（dù）为60%，特异性为（wéi）100%。

5hmC标（biāo）志物可区分病人是单一并发症还（hái）是（shì）多种并发症

50例有并发症的（de）2型糖尿病病人被随机分成训练组（zǔ）（n=25）和测试组（n=25）。利（lì）用弹（dàn）性网络（luò）筛选后发现，13基因-5hmC标志（zhì）物组合可以区分2型（xíng）糖尿病病人（rén）是否发（fā）生单一并发症或多种并发症。

基于（yú）13基因（yīn）组合模型 (Detection Model 2)， 我们计（jì）算了单一并发症和多种并（bìng）发症（zhèng）的加权平均分，发现（xiàn）在训练集和测试集中单（dān）一并（bìng）发症和多种并发（fā）症病（bìng）人的分数（shù）都有明显差异。值得一提的（de）是，有（yǒu）肾（shèn）病并发症和无肾病并发症病人的分（fèn）数也（yě）有明显差异。利用加权平均分（fèn）作为判断（duàn）标准的（de）受试者工作特征曲线（ROC）表明，在测试组中当将cutoff值设成0.69时，灵敏度为87.5%，特（tè）异性为68.8%。

5hmC标（biāo）志物（wù）与传统临床变量/危险因（yīn）子的对（duì）比

我们评估了（le）不（bú）同临（lín）床变（biàn）量（liàng）/危险因（yīn）子用于监测（cè）血管（guǎn）并发症（zhèng）的（de）灵敏度和特异（yì）性（见表1）。

信（xìn）号通路分析和（hé）功能（néng）探究

有并发症（zhèng）和（hé）无并（bìng）发症病人的135个差异候选基（jī）因的功（gōng）能注释分析表明，这些基（jī）因主要富集在一些经典（diǎn）的信号（hào）通（tōng）路。错误发现率相关P值（zhí）位于前10%和基因数（shù）目≥3的信号通路包（bāo）括由（yóu）IGF1R, IL-10和FGFR2所（suǒ）介导的信号通路。由IGF1R和IL-10介（jiè）导的信号通路与胰岛素抵（dǐ）抗及炎症反应相关，在（zài）血管生（shēng）物学和糖尿病发生发展过（guò）程中发（fā）挥重要作用。

Reactome相互作用（yòng）网（wǎng）络的中心表明，泛素编码基因[泛素B (UBB)，泛素C (UBC)，泛素A-52亚（yà）基核糖（táng）体蛋白融合产物（wù）1(UBA52)]是候选基因（如SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的重要连接者。在这135个（gè）差异候（hòu）选基因中, 一些基因 （如TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表现（xiàn）出与糖尿病病程相关的倾向，表明（míng）5hmC和糖尿病血管并（bìng）发症之间可（kě）能存在（zài）时间依赖性的（de）相互（hù）作用。基于纵向时间队列的大样本研究，将（jiāng）可进一步明确（què）5hmC变化和糖尿病持续时间之间（jiān）的动（dòng）态关（guān）联。关于单一并（bìng）发症和多（duō）种并发（fā）症病人的159个候（hòu）选标志（zhì）基因的功能注释研究发现（xiàn），存（cún）在细胞-细胞连接、胶（jiāo）原蛋白形成、新陈代谢、细胞（bāo）应激应答信号（hào）通路的富（fù）集，这些信号通路（lù）均与细（xì）胞基本功能（néng）密切相关。

血管（guǎn）并发症是（shì）三分之二（èr）糖（táng）尿病病人的（de）死亡原因，若能及早有效控制（zhì）血管并发症的（de）发生，将（jiāng）极大地（dì）改善糖尿病（bìng）病人的生存（cún）质（zhì）量（liàng）。该研究（jiū）建立了一种利用cfDNA进行2型（xíng）糖尿（niào）病（bìng）血（xuè）管并发（fā）症（zhèng）监测（cè）的无创便捷方法，较目（mù）前临床（chuáng）标志物能更（gèng）准确（què）地监控（kòng）血管并发症（zhèng）的发生（shēng），从而提示临床及早（zǎo）采取应对措施（shī），有效控（kòng）制病（bìng）情进（jìn）展（zhǎn）。