2019年10月1日（rì），5-羟甲（jiǎ）基化胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在糖（táng）尿病研（yán）究领域取（qǔ）得重要进展。2型糖尿病（T2D）的血管并发症（zhèng）是导致2型糖尿病致残（cán）致死的重要病因，一直缺乏一（yī）种（zhǒng）无创便捷的临床途径实现血管并发症的（de）发生发展监测，达（dá）到早发现、早干预，以提高（gāo）T2D病人（rén）的整体（tǐ）生（shēng）活质量，减少卫（wèi）生经济负担。

该研究入组了62例2型（xíng）糖尿病病人，采用5hmC-Seal技术（shù）对血浆cfDNA中（zhōng）表观遗（yí）传标志物5hmC的分布情况进行检（jiǎn）测，分析5hmC标志（zhì）物与2型（xíng）糖（táng）尿病血管并发症发生发（fā）展的相关性。结果表明5hmC标（biāo）志物的变化（huà）与T2D合（hé）并大血（xuè）管（guǎn）/微（wēi）血管事件具有相关性，主要涉及一（yī）些与血（xuè）管生物学和糖（táng）尿病（包括胰（yí）岛素（sù）耐受（shòu）和炎症反应）相关的基因和信（xìn）号通路。该研（yán）究建立（lì）的16个基因-5hmC标志物组（zǔ）合检测可以准确区分（fèn）有（yǒu）并发症（zhèng）和无并发症的2型（xíng）糖尿（niào）病病人[实验组（zǔ）：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明显优（yōu）于传统临床（chuáng）变量例如白蛋白尿。除此之外，还建立（lì）了（le）13个基因-5hmC标志物组（zǔ）合检测（cè），可以进一步区分T2D合并单一并发症和多种并（bìng）发（fā）症[实验（yàn）组：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同样（yàng）明显优于（yú）其他传统临床变量。该研究得出结论（lùn），5hmC标志物反映了T2D病人大血管/微血管（guǎn）并发（fā）症发生过程中的表观（guān）遗传变（biàn）化（huà），因（yīn）而（ér）5hmC-Seal检测技术在监测（cè）糖尿病（bìng）血管并（bìng）发症（zhèng）发生（shēng）和进展方面具有良好（hǎo）的临（lín）床（chuáng）应用前（qián）景。

本研（yán）究共纳入62例（lì）2型糖尿（niào）病病人（rén），包括没（méi）有血管并发症的病人12例，有单一血管并发症的病（bìng）人34例（24例发生大血管（guǎn）事件，10例（lì）发生微血管事件（jiàn）），以及有多种（zhǒng）血管（guǎn）并发症的（de）病人16例。试验收集（jí）62例（lì）病人血浆（jiāng），提（tí）取cfDNA，利用5hmC-Seal技术捕获外周血cfDNA中的5hmC序列，进行二代测序，通过（guò）生物信息学分（fèn）析找出并发（fā）症组与无并发症组之间有显著（zhe）5hmC修饰差（chà）异的基因，单一并发症组和多种并（bìng）发症组之间（jiān）有显著（zhe）5hmC修（xiū）饰差（chà）异的基因。随后利用回归模型对差异基（jī）因（yīn）进一步筛选、优化（huà），弹性网络进一步筛选，计（jì）算加（jiā）权平均分，最后得到一组具有高度灵敏度和特异（yì）性的5hmC生物标记物，并进一步在实（shí）验组中验证，分析其灵敏（mǐn）度和特异性。并将新建立的5hmC标志（zhì）物基因组（zǔ）合的检测性能与（yǔ）传统临床变量进行对比分析。最后对相关基因（yīn）进（jìn）行了信（xìn）号通路分析和功能探（tàn）究。

5hmC修（xiū）饰水平与血管并发（fā）症具有相（xiàng）关性

利用逻（luó）辑回归模型对（duì）62例有并发症和无并发症2型（xíng）糖尿病病人的5hmC差异（yì）水（shuǐ）平进行分析发现，有（yǒu）并发症2型糖尿病病人的622个差异修饰候选基因（yīn）（包括上调和（hé）下（xià）调基（jī）因）的归一化平均数要明（míng）显高于无（wú）并发症的病人（P<0.001），但是单一并发症（zhèng）和（hé）多发（fā）并发症病人之（zhī）间没有显著差异。

之后将有单一并发症或多种并发症的50例（lì）病人（rén）用逻辑回归（guī）模型（xíng）进行（háng）了（le）对（duì）比（bǐ），发（fā）现（xiàn）多种（zhǒng）并发症的病人的153个差（chà）异修饰候（hòu）选基因（包括上（shàng）调和下调基因）的归一化平均（jun1）数要低（dī）于无（wú）并发症病人（P<0.001）。

5hmC标志物可区分有无（wú）并发症患者

62例2型糖尿病（bìng）病人被随机分成训练组（n=31）和测试组（n=31）。利用弹性网（wǎng）络筛选后发现，16基因-5hmC标（biāo）志物组合（hé）检测可（kě）以用于区分有并发（fā）症和无并发症的2型糖尿病病（bìng）人（rén）。

基于16基因组合模型 (Detection Model 1) 的加权（quán）平均分分析（xī），发（fā）现无并发（fā）症病人的分数在（zài）训练集和测（cè）试集中都明显（xiǎn）低于有并发症的病（bìng）人。只考虑加权平（píng）均分的话（huà），受试者工作特征（zhēng）曲线（ROC）分析表明将cutoff值设置成0.5时，在测（cè）试组中中的灵敏度为（wéi）60%，特（tè）异（yì）性为100%。

5hmC标志物可区分病人是单一并发症还（hái）是多种并发症

50例有并（bìng）发症的2型（xíng）糖尿病病人被随（suí）机分（fèn）成训练（liàn）组（n=25）和测试组（n=25）。利用弹性网络筛选后发（fā）现，13基因-5hmC标志物组（zǔ）合（hé）可以（yǐ）区（qū）分2型糖尿病病人是（shì）否发生单一并发症或多（duō）种并发症。

基（jī）于13基（jī）因组合模（mó）型 (Detection Model 2)， 我们计算了单（dān）一并发症和（hé）多种并发症的加权平均分，发现在训练集和测试（shì）集中单一并发症（zhèng）和多种并发症病人的分数都有明（míng）显差异。值得（dé）一（yī）提（tí）的是，有（yǒu）肾病并（bìng）发症和无肾病并发症病人的分（fèn）数也有明显差（chà）异。利用加权平（píng）均分作为判断标准的受（shòu）试者工作特征曲线（xiàn）（ROC）表明，在测试组中当将cutoff值（zhí）设成0.69时，灵敏度（dù）为87.5%，特异性为68.8%。

5hmC标（biāo）志物与传统临床（chuáng）变量（liàng）/危险因（yīn）子的（de）对比

我们（men）评（píng）估了不同临床（chuáng）变量（liàng）/危险（xiǎn）因子用于监测（cè）血管并发症的灵敏度和特异性（见表1）。

信号通路分析和功能探究（jiū）

有并发症和无并发症病人的135个差异候选基因（yīn）的功能注（zhù）释分析表明，这些（xiē）基因主（zhǔ）要（yào）富集在一些经典的（de）信号通路（lù）。错误（wù）发（fā）现率相（xiàng）关P值位于前10%和（hé）基（jī）因（yīn）数目≥3的信号通路包括由（yóu）IGF1R, IL-10和FGFR2所介（jiè）导的信号通路。由IGF1R和（hé）IL-10介导（dǎo）的信号通路与胰岛素抵抗及炎症（zhèng）反应相关，在血（xuè）管生物学和糖尿病发生发展过（guò）程中发挥重要作用。

Reactome相互（hù）作用网络的（de）中心表明，泛（fàn）素（sù）编码基因[泛素B (UBB)，泛素（sù）C (UBC)，泛（fàn）素A-52亚基（jī）核糖体蛋白融合产物1(UBA52)]是候（hòu）选（xuǎn）基因（如SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的（de）重要连接者（zhě）。在这（zhè）135个（gè）差异候选基因中（zhōng）, 一些基（jī）因 （如TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表现（xiàn）出与糖尿（niào）病病程相关的倾向，表明（míng）5hmC和糖尿病血管（guǎn）并（bìng）发症之（zhī）间可能存在（zài）时间依赖（lài）性的相互作用。基于纵向时间队列的大（dà）样本研究（jiū），将可进一步明确5hmC变化和糖尿病持续时间之间的动（dòng）态（tài）关联。关于单（dān）一并发症（zhèng）和多种并发症病人的159个候选标志（zhì）基因的功能注释（shì）研究（jiū）发现，存在细胞-细胞连接（jiē）、胶原蛋白形成、新陈代谢、细胞应激应答信（xìn）号通路的富集，这些信号通（tōng）路均（jun1）与（yǔ）细胞基（jī）本功能密切（qiē）相关（guān）。

血管并发（fā）症是三分之二糖尿病病人（rén）的死亡原因，若（ruò）能（néng）及早有效控制血管并发症的发（fā）生，将极大地改善（shàn）糖（táng）尿病（bìng）病（bìng）人的生存（cún）质（zhì）量。该研究建立（lì）了一种利用cfDNA进行（háng）2型糖尿（niào）病血管并发症监测的（de）无创便捷方法，较目（mù）前临床标志物能更（gèng）准确地监控血管并发症的发生，从而提示临床及早采取应对措（cuò）施，有效（xiào）控制病情进展。